一般，在二氧化碳培养箱内细胞没有污染的情况下平均1-3个月消毒一次。常用的3种消毒灭菌的方式是：液体消毒剂、紫外和干热。

1、液体消毒剂：选择对二氧化碳培养箱无腐蚀性的液体消毒剂，并且液体消毒剂的消毒效果好坏和很多因素有关。比如：场所的温度、接触时间、pH、穿透能力、有机物的反应。这些因素中的一些很小的变化可能会造成去污剂的效力上大的不同。因此甚至在很有利的情况下，当最终要求必须无菌时，液体去污剂也不是可信赖的去污方法。

2、 紫外消毒：一般先用蒸馏水清洗干净后，再用培养箱自带的紫外灯照射一天。当紫外灯在有遮光罩的情况下照射时，紫外线照射到腔体的次数很少。

3、 干热灭菌：当CO2培养箱用于污染危险区域时，干热灭菌可作为清洁室内的附加手段。干热灭菌采用6面直接加热，加热温度高达125°C。这使得腔体能够破坏细菌。高温（125°C）在培养箱中保持2小时以上。经过8小时的灭菌程序（包括2-3小时的预热时间，具体情况取决于温度），灭菌室内的温度降低并恢复到37°C或上一个程序设定的温度。除了以上几种方法外，还可以采用联合杀菌的方法，几种消毒灭菌的方法同时使用来达到清洁的效果。