显微镜是设计以产生太小，用肉眼可以看到的物体或标本的放大视觉或摄影（包括数字）图像专门光学仪器。 总的来说，工具这个多样组不仅包括多个透镜（ 复式显微镜 ）设计具有物镜和聚光镜，但也包括非常简单的单透镜文书经常手持诸如摄影放大镜或共同放大镜。 利用显微镜是可以由几乎任何人都可以很容易地学会了熟练程度。即使在开关，过滤器，旋钮，滑块，目镜铭文和颜色环上物镜的复杂阵列可以是混乱的，它们容易在短时间内破译。 操作的方法是基于约定很少改变，所以一旦一个新手开始理解和运用该技术的基本原理，成功几乎可以肯定是指日可待。 多年的实践，改进，主张个人创意改变标准方法可以最终改变初学者到主显微镜。

由于这样的事实，大量显微镜用户的依赖于试样的直接观察，这是极其重要的是理解在显微镜和肉眼之间的关系。 无论技术进步的，人眼作为视觉检测器（与脑的组合）是曾经被遇到的的图像处理系统。 有可以在问候成像速度和分辨率匹配人眼的能力没有人为的设备。 操作的底层现代照相机的原理，但是，强烈有关眼睛的结构和操作（参照图1中的解剖描述）。 与肌肉调整透镜一起，角膜的弯曲表面投射的光学图象到视网膜（检测器）。 入射亮度级是通过特定的肌肉的控制下，一个光圈（很像光学膜片）的可变直径控制。 大幅图像被该柔性透镜产生的，其中的焦距由另一组的肌肉的改变，使得可聚焦在约20厘米，无穷大之间的距离的任何物体上。 图像本身是由约1.3亿感光杆细胞（负责识别的灰度级）和700万感光锥细胞（颜色识别）在视网膜上检测到的，并随后通过视神经传送到大脑沿着最短的路径。

在图2中的形式示出的30度视角的光线以证明对人眼的适应为在不同的距离观看对象。 在这种情况下，一个飞行鸭在50米的距离观察而附近的蝴蝶在25厘米的更接近的距离观看。 在接近眼睛对象不能有它们的图象被聚焦在视网膜上的，因为眼睛的晶状体的改变其形状的能力有限。 此外，它是不实际的得到任何距离小于大约10厘米由于被观看到该视场角变得非常小的事实，这就是为什么许多细节是无法辨认的对象。 例如，如果你想拥有在居住在植物的茎细的毛细血管仔细一看（见图3），你将削减一个极薄的薄片从根儿，将其放置在显微镜载玻片上，并使用保护它盖玻片（如在图3（a）所示）。 即便如此，当你持有的成品样品拿到灯光，你会发现很多细节留给显露出来。 你想看到有一个直径只有百分之一或一毫米的甚至千分之一，使他们无法从这样一个伟大的距离来识别，因为视角太小，细节达到视网膜上不同的受体的很多复杂的功能。 类似的情况结果时，我们试图在200米的距离，观察鸭子。 在当前鸟的翅膀在很多复杂的细节和彩色斑纹不能从这样一个很大的距离，因为可视角度太小被识别。 植物茎的放大图示于图3的（b）来说明复式显微镜的倍率。

倍率概念

五百年前，简单的玻璃放大镜开发，以协助观察非常小的物体。 这样的仪器由一个或多个凸透镜，允许样本或对象被定位在所述对象和眼睛之间的放大镜聚焦（在中心比周边更厚）。 有时被称为简单的显微镜 ，他们通过增加视网膜上的视觉角度的处理上显示放大倍数由视网膜上的图像。 图4表示的是如何简单双凸透镜操作的图示。 图像通过眼睛，好像它是在10英寸或25厘米（参考，或常规观看距离）的距离感知。 虽然试样的图像似乎是在透镜作为试件本身的同一侧，它不能被投射到屏幕上。 这些图像被称为虚拟映像和他们出现直立不倒。在一个复式显微镜，图像显示在空间中漂浮的正下方的观测管的顶部（在目镜的固定光阑的水平），其中目镜插入。 你所观察到的是不是有形的; 它不能被掌握。 相反，它是一个地图或各种颜色和/或从黑到白的灰色阴影的试样的代表性。

超过8倍或10倍的倍率不与由于视图所得小字段的简单双凸透镜和事实的透镜必须进入非常接近眼睛非常有用的。 为了实现我们必须使用复式式显微镜，它最初是由荷兰和伽利略詹森兄弟开发了意大利各地的1600年初高放大倍率。 在其的形式中，该仪器是由串联排列两个凸透镜：更靠近物体或标本，和目镜（目镜）透镜更靠近观察者的眼睛的对象的玻璃（通常称为物镜）（附装置调节所述试样和显微镜透镜）的位置。 复式显微镜实现两阶段倍率其中物镜投影放大图像到显微镜和目镜进一步的主体管放大投影的图像。 总放大倍数等于物镜乘以目镜的放大倍数的放大倍数：

的复式显微镜是由光学像差（包括色差和球面）阻碍。 这些缺陷从白光是由无数的波长，并且当光波穿过透镜的周边，它们不与那些通过中心带入焦点的事实造成的。 早期显微镜产生的图像经常被用彩色晕模糊，直到18世纪中期透镜制造商发现，通过组合由玻璃制成具有不同颜色的分散体的两个透镜，大部分的色差可被减少或消除。 现代显微镜通常与用于不同物镜的可互换部件模块化，并且可以有多个透镜布置成一个在另一个后面，从而允许多达2000倍和更高的，并产生了显着的清晰度和对比度的图像的能力的倍率。

示出在图5中的蔡司无限远颜色校正光学系统（ICS）的具有现代显微镜设有管透镜作为物镜加入支持使用原理。 在显微镜光束路径（图5的（a）），该对象或样品被物镜记录和在无穷首先投射与波前或射线的平行束。 实际上，该光线从物镜后面直线，平行线的检体旅行的一个点始发。 管透镜然后以类似的方式的功能的相机聚焦平行射线束，从而产生位于所述目镜内部在其前焦平面的放大中间图像。 目镜，充当第二放大镜，转换中间图像的成平行光线的尺寸。 精密的复式显微镜系统的所得视野角比从直接观察（图5的（b）），其中该对象是直接从大约25厘米的距离看到结果大得多。 其中这些平行束相交的区域被称为眼点 ，而这正是在眼睛的虹膜应设。 角膜和眼睛的透镜集中这些平行光线在视网膜上。 如上所述，总放大倍数等于物镜放大倍率乘以目镜倍率。 在此说明性示例中，在显微镜的整体放大率是100×（10倍的物镜用10倍目镜）。

在选定的数值孔径（物镜乘以成像介质的折射率的角孔径的正弦），其中所述显微镜呈现的放大图像与幅度相当于人眼的分辨率极限的，进一步放大超过这点不会导致更精细的标本细节的分辨率。 为物镜和目镜组合有用总放大倍数的范围是由系统的数值孔径限定。 有对由眼睛来解决必要的图像中存在的的细节的最小放大率，并且该值通常设置在数值孔径500倍（500×NA）。 在光谱的另一端，一个图像的有用倍率通常设置在数值孔径1000倍（1000×NA）。 此限制是由衍射强加于物镜光的波动性设置。 高于此值倍率会产生图像细节更精细的分辨率没有其他有用信息，而且通常会导致图像质量下降。 超出有效的放大倍数的限制导致图像从空的放大倍率 ，其中通过目镜或中间管镜头的放大倍率增加仅使图像变得与细节分辨率没有相应的增加了更多患放大。

倍率这些基本原理背后的复式显微镜的操作和结构。 这些原理的阐述已导致发展，在过去的几百年，今天能够从低生产高品质的图像，以高倍率的精密仪器。

在光学显微镜下，当来自照明源的光通过聚光，然后通过样品，一些光通过这两个周围，并通过在其路径不受干扰试样。 该光称为直接 ，非偏移 或非衍射光，和表示背景光。 一些光与样品相互作用的偏离或衍射。 衍射光呈现半波长或180度的相位与已经没有遇到障碍物穿过直射光。 的二分之一波长的相位差，所引起的试样本身，使该光以引起与直接光消干涉时都在位于目镜的固定光阑的中间像平面到达。 目镜的眼透镜进一步放大这个图像，最终投射到视网膜上，照相机的胶片平面，或光敏感的数字图像传感器的表面上。

现在的情况是，直接或非偏移光由物镜投影并在目镜的膜片在整个图象平面中均匀分布。 由检体衍射的光发生干涉在物镜后焦平面（见图1）和被带入焦点以各种局部地方相同的图像平面上，其中，所述衍射光产生破坏性干扰，并降低强度，造成一个产生上含灰度值从非常暗到非常亮的广泛模式。 亮和暗的这些模式是我们承认作为标本的图像。 因为我们的眼睛在亮度变化敏感，图像变得原始试样的或多或少忠实重建。

为了帮助理解成像的基本原理，建议读者尝试以下的运动，并使用公知的周期性结构的对象作为样品。 这些实验是最容易使用的一个阶段微米或密集的暗线类似光栅进行。 要继续，将精细刻划光栅显微镜载物台上，并使用10倍，然后40倍的物镜，使其焦点。 卸下目镜，并且在它的位置，插入一个相位望远镜这样可以观察到物镜的后侧焦点面。 如果聚光镜孔径光阑闭合大多数的方式，光的明亮的白色点会出现在物镜，这是孔径光阑的图像的后部。 向右侧和左侧的点的，一系列衍射谱（也孔径光阑的图像;在图1中呈现）的将存在，每个彩色蓝色到点的部分，而位于该部分红色从亮点频谱最远（如示于图2）。 这些有色光谱的强度根据多远频谱从点位于减小。

落在物镜的外周附近的那些衍射谱比更靠近点的调光器。 在图2所示的衍射光谱使用三种不同的物镜放大率捕获。 在图2（b）中，在10倍的物镜的后侧焦点面可见的衍射图案包含两个衍射光谱。 如果光栅被从阶段除去，如在图2（a）所示，这些光谱消失，仅孔径光阑的中心图像保持。 如果光栅被重新插入，光谱再次出现。 需要注意的是彩色光谱之间的空间显得较暗。 如果光栅与10x物镜观察可以观察到只有一对光谱。 在这种情况下，一个衍射斑点出现在左边，一个出现在中心孔开口的右侧。 如果行光栅是用40×物镜检查（如图2的（c）），几衍射光谱出现在中心孔的左侧和右侧。 当倍率增加到60倍或63×（并假设它具有较高的数值孔径比40X物镜），几个另外的光谱（参见图2（d））的出现，以左，右的那些与40X物镜可见的到位。

因为当光栅除去有色光谱消失，则可以假定这是通过影响光通过，由此产生的着色光谱检体本身。 此外，如果孔径光阑关闭到一个非常小的开口尺寸，我们将看到，更高的数值孔径的物镜掌握多种这些有色光谱的比做低数值孔径的物镜。 这两个概念对理解图像形成的重要性将成为随后的段落清晰。 光的中心光点（聚光镜孔径光阑的图像）表示直接或非偏移光穿过样品或原状的样品周围（在图3（b）所示）。 这就是所谓的第0或零级。 上零级的各侧的孔径光阑的较暗图像被称为，第二，第三，第四，等等分别订单，如由模拟衍射图案如图3（a）表示，这将在被观察40倍的物镜后焦平面。 所有捕获命令表示，在这种情况下，线光栅作为在物镜的后焦平面可见的衍射图案。

孔径光阑的微弱衍射图像是由衍射波前引起的，在扇形散开，在各线光栅的开口（如图3（b））。 蓝色波长比绿色波长，这是在比红的波长更小的角度衍射的更小的角度衍射。 在物镜的后焦平面，从每个狭缝蓝色波长干涉建设性地产生每个光谱或命令的衍射图像的蓝色区域。 红色和绿色的区域（图3的（a））被隔开的位进一步，但是从同样的现象发生。 其中，衍射波长的一半波为每个这些颜色步骤的，海浪消干涉，以产生光谱或命令之间的暗区。 在零阶的位置，从每个狭缝所有波长建设性添加。 这产生你看到的第零级的明亮的白色光（参见图2，3和4）在物镜的后焦平面的中心。

行的更接近的间隔光栅，光谱越少，将通过给定的物镜被捕获，如在图4（交流）示出。 在图4所示的衍射图（a）用40X物镜成像的下部的线在如图4（b），其中所述狭缝靠得更近光栅捕获。 在图4（c）中，物镜聚焦于线光栅的上部（图4的（b）），其中狭缝是相隔较远，并且更光谱由物镜捕获。 的直接光，并从更高阶的衍射值的光被物镜聚焦在目镜的固定光阑，以在中间像平面的图像。 这里的直接和衍射的光线干涉，并从而重建成由所述目镜的眼透镜看到和进一步放大了真实，倒象。 这在图4（d）通过图4（g）与两种类型的衍射光栅的说明。 在图4（d）所示的正方形网格代表网格的无畸变图象（实际上，通常的检体图像通过目镜观察到的）通过物镜的全孔径看到。 从该网格导出的衍射图案被示为将在物镜的后焦平面（图4（e））的可见一个锥光图像。 同样地，一六角形排列格子的无畸变图象（图4（f））的产生的一阶衍射图案的相应六角形排列锥光图像（图4（g））。

衍射光及解

显微镜标本可以被认为是与细节和开口跨越大范围的尺寸的复杂的线或图案的光栅。 成像的概念在很大程度上是由阿贝，19世纪德国的显微镜和光学理论家发展。 根据阿贝（他的理论仍然被广泛地在目前的时间接受），如果物镜捕捉2个数量的光的，诸如光衍射的1阶和至少第0级的检体的细节将得到解决。 衍射级是获准进入物镜的数量越多，越准确的图像将代表原始对象。 此外，如果折射率高于空气（如浸油）的介质中的空间中使用的物镜的前透镜和盖玻片顶部之间（如所示用于干物镜在图5（a））的的衍射级的角度被减小，衍射光的风扇将被压缩。 其结果是，一个油浸物镜可以捕获更多衍射级和比干物镜（图5（b））的产生更好的分辨率。 比较所捕获的订单在图5（a）和5（b）中。 此外，由于蓝色光以比绿色光或红色光的较小角度衍射，给定孔径的透镜可以捕捉的光的更多的订单时，波长在可见光谱的蓝色区域。 这两个原理解释经典的瑞利方程经常被引用作为计算在显微镜点至点分辨率的基础：

D（分辨率）= 1.22•（λ/2NA）

其中，d是两个相邻的颗粒（还允许颗粒被感知为独立的）之间的空间中，λ是照明的波长，NA是物镜的数值孔径。 假定在显微镜还装有具有相同的数值孔径的物镜的聚光镜（没有聚光镜，分辨率将是一半好导致分辨细节的两倍大）。 允许进入物镜更高衍射级的数量越多，可被清楚地分离或拆分试件的细节越小。 此处是采用高数值孔径物镜用于检查在各个试样的最小可能的信息的值。 同样地，可见光的使用的波长越短，分辨率越高。 这些想法解释为什么高数值孔径，复消色差透镜可以单独在蓝光极小的细节。 在物镜块的最外衍射级的后面放置一个遮光掩膜。 这会减小光栅线的分辨率，或任何其他检体的细节，或它破坏了分辨率，以使试样不可见。 因此，通常小心不要关闭下面物镜的孔径的建议的三分之二聚光镜孔径光阑。

物镜的故障把握在未解决的图像的衍射级的结果的一个以上。 在具有非常微小的细节的检体中，衍射风扇以一个非常大的角度传播，需要高数值孔径物镜捕获它们。 同样，由于衍射球迷在浸油或水的压缩，专为这种用途物镜可以给比干物镜更高的分辨率。如果备用衍射级不被改变（仍假定光栅作为我们的样品），在光栅的行数会出现加倍（寄生分辨率）。 重要的警告是在物镜的介绍后实际行动产生确定的最终图像。 在检体的小细节（相对于线光栅），物镜的直接和衍射光投射到目镜光阑的像平面中的称作艾里斑小的，圆的衍射图案的形式（在图6所示） 。高数值孔径物镜捕获更多的衍射级的生产更小尺寸磁盘将比低数值孔径的物镜。 在图6中，示出艾里斑大小从图6（a）至图6的（c）稳定下降。 在图6中的较大磁盘大小（a）和（b）中通过以较低的数值孔径物镜产生的，而在图6（c）该非常尖锐艾里斑是由非常高的数值孔径的一个物镜产生的。

在目镜膜片水平所产生的图像实际上是被认为是样品的亮和暗区域艾里磁盘的镶嵌。 如果两盘非常接近，他们的核心亮点交叉重叠，这些重叠的圆盘所代表的两个细节都没有解决或分离，从而表现为一个（如图6所示（E））。 与此相反，在图6（d）所示的艾里斑只是足够远，以得到解决。 要记住的基本原理是，直接和衍射光（或直接或衍射光的操纵）的组合是在图像形成至关重要。 对于这种操纵的关键位置是物镜的后侧焦点面和聚光镜的前焦平面。 这个原理就是从根本上大部分的光学显微镜对比改进方法。 更重要的是，它是在高放大倍率特别重要的小细节关闭大小的光的波长。 阿贝在开发这些概念来解释的光吸收或幅度标本成像的。